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電泳實(shí)驗(yàn)中的坑?看完這篇你就懂了!

更新時(shí)間:2024-10-30 瀏覽次數(shù):586次
   電泳技術(shù)就是利用在電場(chǎng)的作用下,由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。
  經(jīng)常做電泳實(shí)驗(yàn)的同學(xué),是否會(huì)經(jīng)常遇到各種各樣的問(wèn)題,不管是核酸還是蛋白電泳,然后找不到解決方法?
  今天大龍君整理了電泳實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常遇到的問(wèn)題,幫助大家更加直觀(guān)的識(shí)別實(shí)驗(yàn)中的“疑難雜癥”。
  一、DNA電泳常見(jiàn)問(wèn)題分析
  1、跑出的DNA帶模糊?
  可能原因1:DNA降解
  解決方法:避免核酸酶污染
  可能原因2:電泳緩沖液陳舊
  解決方法:電泳緩沖液多次使用后,離子強(qiáng)度降低,pH值上升,緩沖能力減弱,從而影響電泳效果。建議經(jīng)常更換電泳緩沖液
  可能原因3:所用電泳條件不合適
  解決方法:電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm,溫度<30℃;巨大DNA鏈電泳,溫度應(yīng)<15℃;核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力
  可能原因4:DNA上樣量過(guò)多
  解決方法:減少凝膠中DNA上樣量
  可能原因5:DNA樣含鹽過(guò)高
  解決方法:電泳前通過(guò)乙醇沉淀去除過(guò)多的鹽
  可能原因6:有蛋白污染
  解決方法:電泳前酚抽提去除蛋白
  可能原因7:DNA變性
  解決方法:電泳前勿加熱,用20mM NaCl緩沖液稀釋DNA
  2、有DNA帶遷移?
  可能原因:1對(duì)于λ/Hind III片段cos位點(diǎn)復(fù)性
  解決方法:電泳前于65℃加熱DNA 5分鐘,然后在冰上冷卻5分鐘
  可能原因2:電泳條件不合適
  解決方法:電泳電壓不超過(guò)20V/cm;溫度<30℃;經(jīng)常更換電泳緩沖液
  可能原因3:DNA變性
  解決方法:以20mM NaCl Buffer稀釋DNA,電泳前勿加熱
  3、跑出的DNA帶弱或無(wú)DNA帶?
  可能原因1:DNA的上樣量不夠
  解決方法:增加DNA的上樣量;聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高,上樣量可適當(dāng)降低
  可能原因2:DNA降解
  解決方法:避免DNA的核酸酶污染
  可能原因3:DNA走出凝膠
  解決方法:縮短電泳時(shí)間,降低電壓,增強(qiáng)凝膠濃度
  可能原因4:對(duì)于EB染色的DNA,所用光源不合適
  解決方法:應(yīng)用短波長(zhǎng)(254nm)的紫外光源
  4、跑出的DNA帶缺失?
  可能原因1:小DNA帶走出凝膠
  解決方法:縮短電泳時(shí)間,降低電壓,增強(qiáng)凝膠濃度
  可能原因2:分子大小相近的DNA帶不易分辨
  解決方法:增加電泳時(shí)間,核準(zhǔn)正確的凝膠濃度
  可能原因3:DNA變性
  解決方法:電泳前請(qǐng)勿高溫加熱DNA鏈,以20mM NaCl Buffer稀釋DNA
  可能原因4:DNA鏈巨大,常規(guī)凝膠電泳不合適
  解決方法:在脈沖凝膠電泳上分析
  二、SDS-PAGE凝膠電泳和Western轉(zhuǎn)移常見(jiàn)問(wèn)題
  1、電泳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)
  可能原因:電泳緩沖液稀,或使用次數(shù)過(guò)多
  解決方法:更換新鮮1×緩沖液
  2、電泳電流過(guò)高
  可能原因:電泳緩沖液稀,或使用次數(shù)過(guò)多
  解決方法:更換新鮮1×緩沖液
  3、條帶模糊
  可能原因1:樣品部分變性
  解決方法:變性蛋白質(zhì)
  可能原因2:樣品部分降解
  解決方法:優(yōu)化蛋白質(zhì)提取過(guò)程,如采用低溫,加入蛋白酶抑制劑等
  4、蛋白帶呈條狀
  可能原因1:樣品中陽(yáng)離子含量過(guò)高
  解決方法:通過(guò)透析、凝膠過(guò)濾等方法去除陽(yáng)離子干擾
  可能原因2:樣品中含污染物,如:DNA、多糖、脂類(lèi)等
  解決方法:優(yōu)化提取方法,如提取緩沖液配比,離心,過(guò)濾等
  可能原因3:樣品沉淀
  解決方法:通過(guò)加熱樣品或增加SDS濃度促進(jìn)樣品溶解或離心除去蛋白質(zhì)沉淀
  可能原因4:上樣量過(guò)高
  解決方法:減少上樣量
  可能原因5:制備凝膠
  解決方法:配置凝膠液時(shí)要混勻;灌膠要連續(xù)
  5、蛋白帶呈“微笑”狀
  可能原因1:各泳道間蛋白質(zhì)含量差異過(guò)大,導(dǎo)致電場(chǎng)不均勻
  解決方法:測(cè)定蛋白質(zhì)含水量,使樣品間蛋白質(zhì)含量一致
  可能原因2:上樣量過(guò)大,導(dǎo)致不堆積
  解決方法:使用適當(dāng)上樣量,如樣量過(guò)稀,采用冷凍干燥或超濾方法濃縮
  可能原因3:凝膠表面或分離膠表面不平
  解決方法:檢查藥品是否過(guò)期,制備凝膠時(shí)使凝膠表面平整
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